Hoʻomaopopo ʻia ka hana o 1 unit (U) Taq DNA Polymerase e like me ka nui o ka enzyme e pono ai e hoʻohui i 10 nmol deoxynucleotides i loko o nā mea acid-insoluble ma 74 ℃ ma loko o 30 mau min e hoʻohana ana i ka salmon sperm DNA e like me template / primer.
ʻO ka maʻemaʻe e ka ʻike ʻana o SDS-PAGE ma mua o 99%; ʻAʻole ʻike ʻia kahi hana o nuclease exogenous; Hiki ke hoʻonui ikaika ʻia ka kope kope kope hoʻokahi i ka genome kanaka; ʻAʻohe loli o ka hana nui ke mālama ʻia i ka mahana o ka lumi no hoʻokahi pule.
Loaʻa ka ʻelima i ka hana polymerase 5'-3 "a me ka hana exonuclease 5" -3, a me ka ʻole o ka hana exonuclease 3 "-5". ʻO ka wikiwiki hoʻonui o ka polymerization DNA he 1-2 kb / min ma 70-75 ℃. Loaʻa i ka huahana PCR he 3'-dA overhangs, hiki ke kloned pololei ʻia i ka vector TA-cloning.
Hoʻohana ʻia ia no ka hoʻonui ʻana, hoʻolōʻihi primer, ke kaʻina ʻana, a me ka huina A i ka hopena ʻōuli o DNA ʻo ia ka <6 kb a he mau koina pono haʻahaʻa kāna.
Hiki ke hoʻonohonoho pono ʻia nā huahana āpau no ODM / OEM. No nā kikoʻī,e kaomi i ka lawelawe i hoʻopilikino ʻia (ODM / OEM)
Ke hoʻohana nei i ka DNA genomic kanaka ma ke ʻano he anakuhi e hoʻonui ai i ka ʻāpana 1 kb | |
Ma hope o ka hopena PCR, e lawe i 5 μl no ka ʻike electrophoresis. |
A-1 anakuhi
■ Loaʻa i ka template ka haumia o ka protein a i ʻole nā mea kāohi Taq, a me nā mea āpau.
■ ʻAʻole piha ka denaturation o ka anakuhi —— Hoʻonui kūpono i ka mahana denaturation a hoʻolōʻihi i ka manawa denaturation.
■ Hoʻohilahila anakuhi —— Hoʻomākaukau hou i ke anakuhi.
ʻO ka Primer A-2
■ Nā maikaʻi maikaʻi ʻole o nā primers ——Re-synthesize i ka primer.
■ Hoʻohaʻahaʻa Primer —— Hoʻohui i nā primers hoʻoliʻiliʻi kiʻekiʻe i loko o ka liʻiliʻi o ka nui no ka mālama ʻana. Hōʻalo i nā anuanu he nui a hoʻoheheʻe a lōʻihi paha 4 ° C cryopreserve.
■ Hoʻolālā kūpono ʻole o nā primers (e like me ka lōʻihi o ka primer ʻaʻole lawa, dimer i hoʻokumu ʻia ma waena o nā primers, a me nā mea ʻē aʻe).
A-3 Mg2+noʻonoʻo
■ Mg2+ haahaa loa ka noonoo —- E hoonui pono i ka Mg2+ noonoo ana: Optimize ka Mg2+ ka noʻonoʻo ma o ka moʻo o nā hopena mai 1 mM a 3 mM me kahi manawa o 0.5 mM e hoʻoholo ai i ka Mg maikaʻi loa2+ ka noʻonoʻo no kēlā me kēia anakuhi a me ka primer.
A-4 Annealing wela
■ Hoʻopilikia ka mahana annealing kiʻekiʻe i ka hoʻopaʻa ʻana o ka primer a me ka template. —E hoʻemi i ka mahana annealing a hoʻonui i ke ʻano me ka gradient o 2 ° C.
A-5 manawa hoʻolōʻihi
■ Manawa hoʻolōʻihi pōkole —- Hoʻonui i ka manawa hoʻolōʻihi.
Phenomena: hōʻike pū kekahi nā laʻana maikaʻi ʻole i nā kāʻei hoʻonohonoho hoʻonohonoho.
A-1 Contamination o PCR
■ Ke hoʻohaumia i ke kaʻina o nā pahuhopu a i ʻole nā huahana hoʻonui ʻana— Pono e hoʻoponopono hou i nā reagents a i ʻole nā pono hana e hoʻopau i nā waikawa nukelika e noho nei, a e hoʻoholo ʻia ka noho ʻana o ka haumia ma o nā hoʻokolohua kaohi maikaʻi ʻole ʻana.
■ Hoʻohaunaele Reagent ——Aliquot i nā mea reagents a mālama i ka mahana haʻahaʻa.
A-2 Kuhina Nuir
■ Mg2+ haahaa loa ka noonoo —- E hoonui pono i ka Mg2+ noonoo ana: Optimize ka Mg2+ ka noʻonoʻo ma o ka moʻo o nā hopena mai 1 mM a 3 mM me kahi manawa o 0.5 mM e hoʻoholo ai i ka Mg maikaʻi loa2+ ka noʻonoʻo no kēlā me kēia anakuhi a me ka primer.
■ ʻO ka hoʻolālā primer kūpono ʻole, a he homology ke kaʻina hoʻokūkū me ke kaʻina hoʻokūkū ʻole. —— Nā hana hoʻolālā hou.
Phenomena: Kūlike ʻole nā hui hoʻonui PCR me ka nui i manaʻo ʻia, nui a liʻiliʻi paha, a i kekahi manawa ʻelua mau band amplification kikoʻī a me nā hui hoʻonui ʻole kikoʻī.
A-1 mea hoʻomaka
■ ʻIno kikoʻī maikaʻi ʻole
——Re-design primer.
■ Kiʻekiʻena ka piʻo primer ——E hoʻonui pono i ka mahana denaturation a hoʻolōʻihi i ka manawa denaturation.
A-2 Mg2+ noʻonoʻo
■ Ka Mg2+ kiʻekiʻena kiʻekiʻe --—E hoʻoliʻiliʻi pono i ka hoʻonui Mg2 +: Optimize ka Mg2+ ka noʻonoʻo ma o ka moʻo o nā hopena mai 1 mM a 3 mM me kahi manawa o 0.5 mM e hoʻoholo ai i ka Mg maikaʻi loa2+ ka noʻonoʻo no kēlā me kēia anakuhi a me ka primer.
A-3 polymerase wela loa
■ Ka nui o ka ʻenemika nui loa—— Hoʻoemi kūpono i ka nui o ka ʻenemika i nā wā o 0.5 U.
A-4 Annealing wela
■ Haahaa loa ka mahana annealing —— Hoʻonui kūpono i ka mahana annealing a i ʻole lawe i ka hana annealing pae ʻelua.
Nā pōʻaiapuni A-5 PCR
■ Nui loa nā pōʻaiapuni PCR ——E hoʻemi i ka helu o nā pōʻai PCR.
A-1 mea hoʻomaka——Pea kikoʻī ——Re-hoʻolālā i ka primer, hoʻololi i ke kūlana a me ka lōʻihi o ka primer e hoʻomaikaʻi i kāna kikoʻī; a i ʻole hana i ka PCR pūnana.
A-2 Template DNA
——ʻAʻole maʻemaʻe ke anakuhi ——E hoʻomaʻemaʻe i ke anakuhi a huki paha i ka DNA me nā pahu hoʻomaʻemaʻe.
A-3 Mg2+ noʻonoʻo
——Mg2+ kiʻekiʻena kiʻekiʻe --—E hoʻemi pono i Mg2+ noonoo ana: Optimize ka Mg2+ ka noʻonoʻo ma o ka moʻo o nā hopena mai 1 mM a 3 mM me kahi manawa o 0.5 mM e hoʻoholo ai i ka Mg maikaʻi loa2+ ka noʻonoʻo no kēlā me kēia anakuhi a me ka primer.
A-4 dNTP
——Ua kiʻekiʻe loa ka hoʻopaʻapaʻa ʻana o dNTPs -
A-5 Annealing wela
——To low annealing mahana ——E hoʻonui pono i ka mahana annealing
Nā pōʻaiapili A-6
——Ua nui loa nā pōʻaiapuni ——E hōʻoia i ka helu pōʻaiapuni
ʻO ka hana mua e koho i ka polymerase kūpono. ʻAʻole hiki i ka Taq polymerase maʻamau ke hoʻoponopono ma muli o ka nele o ka hana 3'-5 'exonuclease, a e hōʻemi nui ka mismatch i ka pono hoʻonui o nā ʻāpana. No laila, ʻaʻole hiki i ka Taq polymerase maʻamau ke hoʻonui pono i nā ʻāpana pahuhopu i ʻoi aku ma mua o 5 kb. Pono e koho ʻia ʻo Taq polymerase me kahi hoʻololi kūikawā a i ʻole polymerase hilinaʻi kiʻekiʻe e hoʻomaikaʻi ai i ka pono hoʻonui a hoʻokō i nā pono o ka hoʻonui ʻana i nā ʻāpana lōʻihi. Hoʻohui ʻia, koi ʻia ka hoʻonui ʻana i nā ʻāpana lōʻihi e like me ka hoʻoponopono ʻana o ka hoʻolālā primer, ka manawa denaturation, manawa hoʻolōʻihi, buffer pH, a me nā mea maʻamau. I mea e pale aku ai i ka hōʻino template, pono e hoʻēmi ʻia ka manawa denaturation ma 94 ° C i 30 sec a i ʻole emi no ka pōʻaiapuni, a me ka manawa e piʻi ai ka mahana i 94 ° C ma mua o ka hoʻonui ʻana ma mua o 1 min. Eia kekahi, ke hoʻonohonoho nei i ka mahana hoʻolōʻihi ma kahi o 68 ° C a hoʻolālā i ka manawa hoʻolōʻihi e like me ka helu o 1 kb / min hiki ke hōʻoia i ka hoʻonui ʻana i nā ʻāpana lōʻihi.
Hiki ke hoʻemi ʻia ka helu hewa o ka hoʻonui ʻana i ka PCR ma o ka hoʻohana ʻana i nā polymerases DNA like ʻole me ke kūpaʻa kiʻekiʻe. Ma waena o nā Taq DNA polymerases i loaʻa a hiki i kēia manawa, ʻo Pfu enzyme ka hapa haʻahaʻa haʻahaʻa a me ke kūpaʻa kiʻekiʻe loa (e ʻike i ka papa i hoʻopili ʻia). Ma waho aʻe o ke koho ʻana o ka enzyme, hiki i nā mea noiʻi ke hōʻemi hou i ka helu mutation PCR ma o ka hōʻoia ʻana i nā kūlana hopena, e like me ka hoʻonui ʻana i ke ʻano buffer, ka nui o ka polymerase thermostable a me ka hoʻonui ʻana i ka helu pōʻai PCR.
Mai kona hoʻokumu ʻia ʻana, ke hoʻomohala nei kā mākou hale hana i nā huahana papa honua mua me ka hoʻopaʻa ʻana i ke ʻano
o ka maikaʻi ma mua. Ua loaʻa i kā mākou huahana ka maikaʻi maikaʻi loa i ka ʻoihana a me ka waiwaiabletrusty i waena o nā mea kūʻai aku a kahiko.