FastKing RT Kit (Me gDNase)

Heluhelu kūpono i nā ʻano kau a ʻike pololei i nā anakuhi haʻahaʻa.

ʻO FastKing RT Kit (Me gDNase) kahi ʻōnaehana transcript huli pono wikiwiki, hiki ke hemo i ka genomic DNA haumia. Aia i loko o ka pahu ka gDNase no ka hemo ʻana o ka genomic DNA, akā ʻaʻole ia e hoʻohuli i ka maikaʻi cDNA. Kūpono ka transcriptase wikiwiki hope loa ʻo FastKing RT Enzyme no nā anakuhi RNA me ka ʻike maʻamau a kiʻekiʻe GC paha a me ka hale lua paʻakikī a i ke kūpaʻa koʻikoʻi.

Pōpoki. Aʻole Ka hōʻiliʻili nui
4992223 25 rxn
4992224 100 rxn
4992250 1000 rxn

ʻIke kikoʻī

Laʻana Hoʻokolohua

FAQ

Nā huahana huahana

Hiʻona

■ Kūlana kiʻekiʻe: Hoʻololi ʻia ka FastKing RT Enzyme me ka motif hydrophobic, me ka pono RT ma mua o 95%.
■ Sensitive: Ma lalo o 1 ng template hiki ke ʻike pololei.
■ Kūʻē: Hiki i ka hoʻohuli hope o nā anakuhi paʻakikī, me ke kūpaʻa kūpono ʻana i nā haumia.
■ Flexible: Ua hoʻopau ʻokoʻa ʻia ka wehe ʻana o Genomic DNA a me ka transcription hope. Hoʻohui ʻokoʻa ʻia nā Primers i loko o kahi paipu, maʻalahi e hoʻololi i nā primers ʻē aʻe.

Hoakaka

ʻAno: ʻO Gene i hoʻololi i ka transcriptase huli, gDNase
Nā Kaʻina Hana: ʻElua-ʻanuʻu (genomic DNA wehe a me RT)
Ka maikaʻi RT:> 95%
Hōʻikeʻike: 1 ng- 2 μg
Ka manawa hana: ~ 21 min
Nā noi: hiki ke hoʻohana ʻia ka cDNA huli i hope i PCR maʻamau, PCR manawa maoli, kūkulu hale waihona cDNA.

21 mau hopena i hoʻokahi paipu

Lawe wale ia he 21 min e hoʻopau ai i ka hemo ʻana o ka gDNA a me ke kaʻina hana hoʻohuli hoʻohuli kūpono i loko o ka paipu like me ka ʻole o ka hoʻololi ʻana i ka paipu hopena a me ke kaʻina hana DNase I kūʻokoʻa. Ke hoʻohālikelike ʻia me ka hana kuʻuna e koi ai i ka hana 12-step a me ka 140 min react, hoʻomaikaʻi nui ia i nā kaʻina hana a mālama i kahi manawa hana.

21 min reaction in one-tube

ʻO ke kūlana poʻokela o King RTase

——Ua hoʻohana ʻia ka transcription hope kiʻekiʻe-kiʻekiʻe
——Ua ʻoi aku ka maikaʻi o ka lawe palapala ma 95%
Loaʻa i ka transcriptase hoʻohuli hoʻohuli hoʻohuli huli pono o 40-60%, a hiki ke hoʻonui ʻia ka hua cDNA e kahi nui o ka hoʻouka ʻana o RNA. Hiki i ka Mōʻī hope transcriptase ke hoʻokō i kahi kahakaha transcription hope o ʻoi aku ma mua o 95% ma muli o kāna kūlana kiʻekiʻe kiʻekiʻe no nā anakuhi RNA. No laila, hiki ke māʻona nā hoʻokolohua hope me ka ʻole o ka nui o ke komo ʻana o RNA, nāna e mālama iā RNA a hiki i ka maʻemaʻe kiʻekiʻe a me nā hua kiʻekiʻe o cDNA.
Outstanding quality of King RTase

E heluhelu maʻalahi ma o nā anakuhi paʻakikī

—E heluhelu maʻalahi ʻia ma o GC a me nā anakuhi paʻakikī
Loaʻa i ka RNA kū hoʻokahi hoʻokahi ka laulā o nā ʻāpana lua o nā ʻano ʻoihana lua ma muli o ka hoʻopaʻa ʻana o ka hydrogen ma waena o nā kaula. Hiki i ke transcriptase huli maʻamau ke alakaʻi i ka hoʻopau ʻana o ka transcript huli ke kū ʻana i kahi hanana lua paʻakikī, no laila ʻaʻole hiki ke hoʻopau maikaʻi i ka synthes cDNA. Eia nō naʻe, he mana kū hoʻokahi ko ka hanauna hou o King reverse transcriptase, i hiki ke hoʻopau i ka pili o ka hydrogen ma waena o nā kaula RNA, no laila e wehe ana i ka hoʻolālā lua o RNA a me ka hōʻoia ʻana i ka transcript reverse smooth.

Easily read through complex templates

Hiki ke hoʻonohonoho pono ʻia nā huahana āpau no ODM / OEM. No nā kikoʻī,e kaomi i ka lawelawe i hoʻopilikino ʻia (ODM / OEM)


  • Previous:
  • Aʻe:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×
    Experimental Example Pūʻulu 1: Reverse transcript me ka ʻole o gDNase lapaʻau; Pūʻulu 2: ʻAʻohe mālama gDNase a ʻaʻohe palapala huli kua; Pūʻulu 3: Reverse transcription ma hope o ka mālama ʻana gDNase; Pūʻulu 4: gDNase lapaʻau me ka ʻole o ka palapala hou. Nā Kiʻina hana: ʻIke ʻia ka nui o PCR fluorescence o ka ʻāpana TNF-alpha (primer i hoʻolālā ʻia ma exon me cDNA a i ʻole genome ma ke ʻano he anakuhi) e hoʻohana ana i ka 1 μg Hela cell RNA (me ke koena genome) ma ke ʻano he anakuhi. ke koena o ka genome ma RNA, hiki i ka hui 3 ke hōʻike pololei i ka pae hōʻike maoli o ka TNF-alpha, he hewa nā hui 1 i nā hopena helu hope loa ma muli o ke koena genome, a hōʻike ka hui 4 e hiki iā FastKing RT Kit ke hoʻopau loa i ke koena genomic DNA i RNA.
    Experimental Example Kiʻi 1. Ua hana ʻia ka transverse Reverse o ka ʻiole RNA me ka hoʻohana ʻana iā TIANGEN FastKing RT Kit (hema) a me ka huahana pili pono o ka mea hoʻolako A (ʻākau), a laila hoʻonui ʻia ka nui MM5 me ka hoʻohana ʻana iā TIANGEN SuperReal PreMix Plus (SYBR Green). Ua kālailai ʻia ka piʻo hoʻonui a me ka piʻo hoʻoheheʻe. ʻO ka hoʻokomo o RNA he 1000 ng, 100 ng, 10 ng a me 1 ng pākahi. Hōʻike nā hopena i kā TIANGEN FastKing RT Kit he gradient transcription hope a me ka waiwai Ct haʻahaʻa, a he maikaʻi maikaʻi loa no ka huli hope ʻana o ke anakuhi haʻahaʻa (1 ng, pua polū).
    Experimental Example Kiʻi 2. Kope hoʻohuli o ka template RNA maʻamau (ʻulaʻula), template me ke koena phenol nui (ʻōmaʻomaʻo) a me ka template me ke koena ʻona (polū) o nā ʻiole e hoʻohana ana iā TIANGEN FastKing RT Kit a me ka huahana pili pono o ka mea hoʻolako A, e helu i nā gen RNC me ka hoʻohana ʻana iā TIANGEN SuperReal. PreMix Plus (SYBR Green), a ua kālailai ʻia nā kaha hoʻonui a me nā helu Ct. Hōʻike nā hopena i loaʻa iā TIANGEN FastKing RT Kit ka waiwai haʻahaʻa Ct ma hope o ka transcription hope a me ke kūpaʻa koʻikoʻi maikaʻi, a he maikaʻi maikaʻi loa no nā template me nā koena haumia kiʻekiʻe.
    Q: Liʻiliʻi a ʻaʻole paha huahana RT-PCR

    Hoʻohaʻahaʻa ʻia ʻo A-1 RNA

    ——E hoʻomaʻemaʻe i ka RNA kiʻekiʻe me ka hoʻohaumia ʻole. Pono e mālama i nā mea mai RNA i lawe ʻia e pale ai i ka hoʻohaʻahaʻa RNA. Nānā i ka pono RNA ma ka gel denatured ma mua o ka hopena RT. Ma hope o ka hemo ʻana o RNA, pono e mālama ʻia ma 100% formamide. Inā hoʻohana ʻia ka mea kāohi ʻo RNase, pono ka mahana hoʻomehana <45 ° C, a ʻo ka pH ma lalo o 8.0, i ʻole e hoʻokuʻu ka mea pāpā i nā RNase āpau i hoʻopaʻa ʻia. Eia kekahi, pono e hoʻohui i ka mea kāohi RNase i nā hopena i loaʻa ka 8 0.8 mM DTT.

    Aia nā A-2 RNA i nā mea kūpale o nā huli hope transcription

    ——Ua hoʻopili nā mea hoʻohuli transcript me SDS, EDTA, glycerol, sodium pyrophosphate, spermidine, formamide, paʻakai guanidine, a pēlā aku. Hoʻohui i ka RNA kāohi me ka laʻana, a hoʻohālikelike i ka hua me ka hopena RNA kaohi e nānā inā aia he mea kāohi. E holoi i ka ua RNA me 70% (v / v) ethanol e hemo i nā mea kūpale.

    A-3 lawa ʻole ka hoʻohui ʻāina o nā primers i hoʻohana ʻia no ka synthesizing ʻana i ka pae mua o cDNA

    —— E hoʻoholo e kūpono ka mahana annealing no nā primers i hoʻohana ʻia i ka hoʻokolohua. No nā hexamers manuahi, koi ʻia e mālama i ka mahana ma 25 ° C no 10 min ma mua o ka hōʻea ʻana i ka mahana hana. No nā primers kikoʻī (GSP), e hoʻāʻo i kahi GSP ʻē aʻe, a i ʻole hoʻololi i ka oligo (dT) a i ʻole hexamer random.

    A-4 Liʻiliʻi o ka hoʻomaka ʻana iā RNA

    ——E hoʻonui i ka nui o ka RNA. No nā laʻana RNA ma lalo o 50 ng, 0.1 μg a 0.5 μg acetyl BSA hiki ke hoʻohana ʻia i ka strand cDNA synthes mua.

    A-5 ʻAʻole hōʻike ʻia ke ʻano pahuhopu i nā aʻa i nānā ʻia.

    ——E hoʻāʻo i nāʻiʻo.

    Hoka A-6 PCR

    ——No RT-PCR ʻelua ʻanuʻu, ʻaʻole hiki ke anakuhi cDNA i ka ʻanuʻu PCR ma mua o 1/5 o ka nui o ka pane.

    Q: Hōʻike ʻia nā pēpili kikoʻī ʻole

    A-1 Hoʻohui kūlike ʻole o nā primers a me nā template

    ——ʻO ka 3'-end o nā primers ʻaʻole pono e loaʻa iā 2-3 dG a i ʻole dC. E hoʻohana i nā primers kikoʻī Gene i ka syntandy strand mua ma kahi o nā primer random a i ʻole oligo (dT). E hoʻohana i kahi mahana annealing kiʻekiʻe ma nā pōʻaiapuni mua, a laila ka mahana annealing haʻahaʻa. E hoʻohana i ka hoʻomaka-wela Taq DNA polymerase no PCR e hoʻomaikaʻi ai i ka kikoʻī o ka hopena.

    A-2 Hoʻolālā maikaʻi ʻole o nā primers kikoʻī

    ——E hāhai i nā loina like no ka hoʻonui ʻana i ka hoʻolālā primer.

    A-3 RNA i hoʻohaumia ʻia me ka genomic DNA

    —— Hana iā RNA me PCR-grade DNase I. Hoʻonohonoho i kahi hopena kaohi me ka ʻole o ka transcription huli e ʻike ai i ka hoʻohaumia ʻana o DNA.

    A-4 Hoʻokumu i ka dimer primer

    —— Hoʻolālā i nā primers me ka ʻole o nā kaʻina kōkua ma ka hope 3 '.

    A-5 kiʻekiʻe loa Mg2+ noʻonoʻo

    ——E hoʻopau iā Mg2+ ka noʻonoʻo no kēlā me kēia anakuhi a me ka hoʻohui primer

    Hoʻopili ʻia ʻo A-6 me DNA haole

    —— E hoʻohana i nā ʻōlelo aʻoaʻo kūpaʻa i nā aerosol a me nā enzyme UDG.

    Q: Paʻa hoʻoliʻiliʻi

    A-1 kiʻekiʻe loa ka ʻike o ka huahana strand mua

    ——E hoʻemi i ka nui o ka huahana strand mua i ka paepae hopena PCR maʻamau.

    A-2 ʻOi aku ka nui o ka primer nui i ka hopena PCR

    ——E ho'ēmi i ka hoʻokomo o ka primer.

    A-3 Nui loa nā pōʻaiapuni

    ——E hōʻoia i nā ʻano hopena PCR a hoʻemi i ka helu pōʻai o PCR.

    A-4 Haʻahaʻa annealing wela wela

    —E hoʻonui i ka mahana annealing e pale ai i ka hoʻomaka ʻole kikoʻī ʻana a me ka hoʻolōʻihi.

    A-5 Hoʻonui i ka kikoʻī o nā ʻāpana oligonucleotide i hoʻokumu ʻia e DNase degradation o DNA -

    Q: Pehea e koho ai i nā primers no RT-PCR?

    RT-PCR e hoʻohuli i ka unuhi hou ʻana iā RNA i cDNA, a laila e hoʻohana i ka cDNA i unuhi hou ʻia ma ke ʻano he anakuhi no ka hopena PCR e hoʻonui ai i ka ʻāpana pahuhopu. Koho i nā primers kaulele, Oligo dT a me nā geners kikoʻī kikoʻī e like me nā kūlana kikoʻī o ka hoʻokolohua. Hiki ke hoʻohana ʻia nā primer a pau i luna no ka mRNA cell eukaryotic pokole me ka ʻole o ka hanana hairpin.

    Random primer: Kūpono no ka RNA lōʻihi me ke ʻano hairpin, a me nā ʻano RNA āpau e like me rRNA, mRNA, tRNA, a pēlā aku. Hoʻohana nui ʻia lākou no ka hopena RT-PCR o hoʻokahi anakuhi.

    Oligo dT: Kūpono no RNA me ka huelo PolyA (prokaryotic RNA, ʻaukaryotic Oligo dT rRNA a me tRNA ʻaʻohe huelo PolyA). Ma muli o ka paʻa ʻana o Oligo dT i ka huelo PolyA, koi ʻia ke kiʻekiʻe o nā laʻana RNA e kiʻekiʻe, a ʻo kahi liʻiliʻi o ka hoʻohaʻahaʻa e hoʻoliʻiliʻi nui ia i ka nui o ka synthes cDNA piha.

    ʻO ka primer kikoʻī Gene: Hoʻohui i ke kaʻina anakuhi, kūpono i nā kūlana kahi i ʻike ʻia ai ke kaʻina target.

    Q: Pehea e hōʻoia ai i ka kūleʻa o ka RNA huli hou i ka strand cDNA mua?

    ʻElua ala:

    1. Ke ʻano kuhikuhi kūloko: I ke kumumanaʻo, cDNA nā ʻāpana DNA o nā lōʻihi like ʻole, no laila ka smear ka hopena o electrophoresis. Inā haʻahaʻa ka nui o RNA, ʻaʻohe huahana e hōʻike i electrophoresis, akā ʻaʻole ia he manaʻo ʻaʻole e hoʻonui ʻia kahi huahana e PCR. Ma ke ʻano laulā, hiki ke hoʻohana i ka kūmole kūloko e ʻike ai iā cDNA. Inā loaʻa nā hualoaʻa o ka kūloko, hiki ke hōʻoiaʻiʻo ʻia ka maikaʻi o cDNA (i kekahi mau hihia, inā lōʻihi ke ʻāpana o ka ʻāpana target, aia paha he mau ʻokoʻa).

    2. Inā aia kekahi ʻiʻo i ʻike ʻia e hoʻonui ʻia e kēia anakuhi, hiki ke hōʻoia ʻia e nā primers o kēia gen. ʻAʻole ka manaʻo o ka hoʻonui ʻana i kahi kūloko i ka manaʻo ʻaʻohe pilikia me cDNA. Ma muli o ka nui o ka ʻike kūloko i ka cDNA, maʻalahi ka hoʻonui ʻana. Inā hoʻohaʻahaʻa hapa ʻia ʻo cDNA no nā kumu like ʻole, mai ke kuanaʻike o ka likelika, e hoʻopili nui ʻia nā hopena PCR o nā genes target low haʻahaʻa. ʻOiai kiʻekiʻe o ka nui o ka kūloko, ʻaʻole paha e hoʻopili ʻia ka hoʻonui ʻana.

    Q: Hiki i ka RT-PCR ke hoʻonui i nā genes kūloko akā ʻaʻole nā ​​gen target

    Hoʻohaʻahaʻa hapa o RNA. Kuhi i ka pono a hoʻomaʻemaʻe o RNA

    ʻOkoʻa ka ʻike o ka RNA o nā ʻano like ʻole, akā i ka laulā, pono i ka RNA i unuhi ʻia i ʻelua mau pūʻulu 28S a me 18S i hoʻoili ʻia i nā gel electrophoresis, a ʻo ka ʻōlinolino o ka pā mua e ʻoi aku ka kiʻekiʻe ma mua o ka hope. Hōʻike ka pae 5S i ka hoʻohaʻahaʻa ʻia o RNA, a kūlike ka ʻōlinolino i ka pae o ka hoʻohaʻahaʻa. ʻO ka hoʻonui ʻana i ke kūmole kūloko ʻaʻole ia he kumu no ka pilikia ʻole o ka RNA, no ka mea, ʻo ka nui o ka kūloko kūloko, hiki ke hoʻonui ʻia ʻo RNA inā ʻaʻole koʻikoʻi ka hoʻohaʻahaʻa. ʻO ka OD260/ OD280ka lakio o ka RNA maʻemaʻe i ana ʻia e ka spectrophotometer ma waena o 1.9 a me 2.1. ʻO kahi liʻiliʻi o ka haumia protein i RNA e hōʻemi i ka lakio. ʻOiai ʻaʻole haʻahaʻa ka waiwai, ʻaʻole e hoʻopili ʻia ka RT. ʻO ka mea nui no RT ka pono RNA.

    Q: Pehea e hōʻoia ai i ka kūleʻa o RT?

    ʻO ka hoʻolōʻihi ʻia o ka ʻāpana kūmole kūloko hiki ke hōʻike wale ua kūleʻa ʻo RT, akā ʻaʻole ia e pili pono i ka maikaʻi o ka strand cDNA. Ma muli o ka liʻiliʻi o ka nui o nā ʻāpana kūmole i ka nui a kiʻekiʻe ke ʻano o ka ʻōlelo, ʻoi aku ka maʻalahi o ka kūleʻa ʻana i ka unuhi hou. Eia nō naʻe, ʻokoʻa ka nui a me ka haʻi ʻana o ka ʻāpana target i kēlā me kēia ʻāpana. ʻAʻole hiki ke hoʻokolokolo ʻia ka maikaʻi cDNA e ka kūmole kūloko ʻoiai no nā ʻāpana pahuhopu i ʻoi aku ma mua o 2 kb.

    Loaʻa i kekahi mau laʻana nā hale kekona paʻakikī, a i ʻole ka waiwai GC momona, a i ʻole mea makamae me ka haʻahaʻa haʻahaʻa. I kēia mau hihia, pono e koho ʻia i transcriptase huli kūpono e like me ka nui o ka ʻāpana target a me ka laʻana. No nā anakuhi RNA me ka ʻike GC kiʻekiʻe a me ka hale lua paʻakikī, paʻakikī e wehe i ka hale lua i ka mahana haʻahaʻa, a i ʻole transcriptase hoʻi maʻamau. No kēia mau anakuhi, hiki ke koho ʻia ʻo Quant Reverse Transcriptase, no ka mea, ʻoi aku ka maikaʻi o kāna hana transcription ma mua o ka M-MLV series reverse transcriptase, i hiki ke hoʻohuli i ka transcript i nā template RNA me ka maikaʻi a unuhi i ka RNA i loko o ka cDNA pae mua i ka palena nui. Ke hoʻohana nei i ka kit transcriptase huli maʻamau, hiki i ka ʻōnaehana 20 μl ke hoʻohuli pono i ka transcript 1 μg o ka huina RNA. E ʻoluʻolu e hoʻolohe i ka nui o ka mana RT o ka kit. Inā hoʻohui ʻia ke anakuhi i ka nui aʻe, e aloha ka transcription huli i ka RNA me ka nui nui. No laila, ʻoi aku ka maikaʻi ʻaʻole e ʻoi aku i ka palena nui o ka ʻōnaehana.

    Q: ʻAʻole hiki i ka RT-PCR ke hoʻonui i ka moʻokūʻāina kūloko

    A-1 Hoʻoholo inā hoʻohaʻahaʻa loa ʻia RNA a inā kūleʻa ʻo RT

    Ma ke ʻano laulā, ʻo ke kumu o ka holo pono ʻole o ka hoʻonui i ka hoʻonui i ka hoʻonui pinepine ʻia ʻana e ka degradation RNA koʻikoʻi. ʻO kekahi kumu kūpono ke hoʻohuli hoʻohuli hoʻohoka ʻole. ʻAʻole hiki ke hoʻohana ʻia kahi kūmole kūloko i mea maʻamau e hoʻokolokolo ai i ka maikaʻi o cDNA strand hoʻokahi, akā hiki ke hoʻohana ʻia ma ke ʻano he hoʻokolokolo no ka kūleʻa ʻana o ka transcription hoʻohuli inā ʻaʻohe pilikia o ka maikaʻi RNA. ʻO ka mea nui i ke kaʻina transcription huli e mālama i ka mahana mau a me ka ʻōnaehana hopena mau i mea e hoʻomaikaʻi ai i ka hopena o ka hopena.

    A-2 E hoʻoholo inā he hilinaʻi nā primers no ka hoʻonui ʻana i nā genes kūloko a inā he pilikia me nā reagents i hoʻohana ʻia ma PCR.

    Q: Ke ʻimi nei i ka pae RNA no ka nui o ka helu, pono anei e hoʻohuli i ka transcript i cDNA ma lalo o ke ʻano e kūlike ka RNA konsentration o kēlā me kēia hāpana?

    No ka helu kikoʻī ʻana, pono e helu ʻia ka RNA ma mua o ka huli hou ʻana, a koi ʻia hoʻi i nā kime unuhi hope he nui, no ka laʻana, e helu i ka hoʻokomo RNA me 1 μg. ʻOiai ʻo ka cDNA huli i huli ʻia he hopena kāwili ʻia, e laʻa me RNA, oligo dT, enzyme, dNTP, a ʻo kahi koena hoʻi o DNA, e hoʻoili ʻia ka hoʻololi, no laila ʻaʻole hiki ke helu pono i ka cDNA. No laila, pono ka helu RNA. Ke noʻonoʻo nei i ka pono o ka transcription hope he mea like ia i waena o nā laʻana like ʻole, ʻo ka nui o cDNA i loaʻa e like ia, a hiki i ka hōʻuluʻulu helu ke hōʻike i ka hoʻohālikelike o nā pae hōʻike o nā genes ʻokoʻa i ka nui like o ka nui RNA. Ke hana nei i ka PCR helu nui fluorescence, ʻaʻole pono e koi ʻia ka cDNA nui ma hope o ka hoʻohuli hou ʻana no ka mea hiki ke hana ʻia ka ʻāpana kūloko i kūmole.

    Q: Hiki paha ke hoʻohuli i ka transcript i nā ʻāpana lōʻihi?

    Pili nui ia i nā ʻiʻo, a ʻaʻole hiki ke huli i ka palapala i nā ʻāpana lōʻihi no ka hapa nui o nā ʻiʻo. ʻO ka mea mua, ʻoi aku ka haʻahaʻa o ka pono o ka huli hope ʻana ma mua o ka PCR. ʻO ka lua, ʻo ka ʻāpana waiwai GC a me ke ʻano ʻelua o nā ʻāpana he nui e pāpā ana i ka transcription hope a me ka PCR. ʻO ka mea hope loa, paʻakikī ka hōʻoiaʻiʻo a me ka hoʻonui amplification o PCR i ka manawa like. I ke kaʻina o ka huli hou ʻana, ʻaʻole hiki i kekahi ke hōʻoia i ka loaʻa ʻana o kahi ʻāpana lōʻihi no nā genes kope haʻahaʻa, keu hoʻi me ka hoʻohana ʻana i ka oligo dT. No 5 'UTR me nā GC hou aku, ʻoi aku ka paʻakikī. No laila, he ʻano kūpono nō ia e hoʻohuli i ka transcript me nā primer random, e ʻike i nā kahua cleavage kūlohelohe i ka ʻāpana pahuhopu, hoʻonui ʻia e nā ʻāpana, a laila hana i ka palena o ka digestion a me ka ligation. Ma ka laulā, paʻakikī e hoʻonui pololei i nā ʻāpana i ʻoi aku ma mua o 2 kb, akā ʻaʻole hiki ʻole ke kiʻi ʻia i nā manawa āpau: 2.M-MLV RT-PCR kit hiki ke hoʻohana pono ʻia. E hoʻolōʻihi i ka manawa hoʻohui ʻāina a hoʻonui i ka helu pōʻaiapuni i ke kaʻina hoʻonui. ʻOkoʻa, hiki ke hoʻopili ʻia PCR i hoʻopaʻa ʻia, a i ʻole lawe i hoʻokahi a i ʻole ʻelua mau hopena me ka denaturation hoʻolōʻihi ʻia a me ka manawa hoʻonui ma mua o ka hoʻonui ʻana o PCR maʻamau, i hiki ke kōkua i ka hoʻolōʻihi ʻana i nā ʻāpana. E hoʻolohe i ka kūpaʻa o ka polymerase. 3.Long Taq hiki ke hoʻohana i PCR e loaʻa ai nā hopena maikaʻi. 4.No ka noi expression protein, pono e hoʻopili i ka polymerase pono kiʻekiʻe.

    Q: Nā hiʻohiʻona huahana o Quant / King Reverse Transcriptase a me kona ʻokoʻa mai TIANScript M-MLV.

    ʻElua ʻano o hope transcriptase i hāʻawi ʻia e TIANGEN: Quant / King RTase a me TIANScript M-MLV. ʻO ka ʻokoʻa nui ma waena o lākou ka nui o nā template. ʻO Quant kahi transcriptase huli kū hoʻokahi, ʻokoʻa ia mai ka M-MLV i hoʻohana mau ʻia i loaʻa mai iā Moloney murine leukemia virus. ʻO Quant kahi transcriptase huli hou kū pono kiʻekiʻe i hōʻike hou ʻia e ka ʻenehana ʻo Escherichia coli. Kūpono ʻo Quant no ka hoʻonui ʻana i 50 ng-2 μg o RNA me ka hana transcriptional kiʻekiʻe a me nā hua kiʻekiʻe. Hoʻohālikelike ʻia me MMLV maʻamau a i ʻole AMV, ʻo ko Quant ʻano nui loa ʻo ia ka ikaika loa o ka pilina me nā template RNA a hiki ke hoʻohuli i nā template transcript me ka ʻole o ka mahana kiʻekiʻe. No nā anakuhi me ka ʻike GC kiʻekiʻe aʻe, ʻoi aku ka kiʻekiʻe o ka huli i hope. Eia nō naʻe, he hana RNase H kēia transcript hope, i hiki ke hoʻopili i ka lōʻihi o ka huahana cDNA (kūpono no nā template <4.5 kb). No ka transcript huli maʻamau, paipai ʻia ʻo TIANScript MMLV huli transcriptase. ʻO kēia RTase kahi enzyme i hoʻololi ʻia me ka hana RNase H nāwaliwali loa, kahi kūpono no ka synthes cDNA lōʻihi (> 5 kb).

    Q: Pehea e koho ai ma waena o hoʻokahi-ʻanuʻu a me ʻelua ʻanuʻu RT-PCR?

    Hoʻopau hoʻokahi transcript huli a me ka hoʻonui PCR i ka paipu like me ka wehe ʻole o ka uhi o ka pahu ma waena o ka synthes cDNA a me ka hoʻonui ʻana, he mea kōkua ia e hōʻemi i ka haumia. Ma muli o ka hoʻohana ʻia ʻana o nā laʻana cDNA āpau no ka hoʻonui ʻana, ʻoi aku ka kiʻekiʻe o ka ʻike, me ka liʻiliʻi o 0,01 pg o ka huina RNA. No ka holomua RTPCR o hoʻokahi anuu, hoʻohana pinepine ʻia nā primers kikoʻī e hoʻomaka i ka synthes cDNA. ʻO ke ala ʻelua ʻanuʻu, ʻo ia hoʻi ka transcription hope a me ka hoʻonui ʻana o PCR i nā ʻanuʻu ʻelua. Lawe mua ʻia ka transcription hoʻohuli ʻia mai kahi anakuhi RNA e kiʻi iā cDNA, a hāʻawi ʻia ka cDNA i loaʻa i hoʻokahi a i ʻole nā ​​ʻano ʻē aʻe PCR. Hiki i ke kiʻina ʻanuʻu ʻelua ke hoʻohana i ka oligo (dT) a i ʻole nā ​​primers kaulele e alakaʻi i ka synthesis o ka strand mua o cDNA, a hiki ke hoʻohuli i ka lawe ʻana i ka ʻike mRNA āpau mai kahi laʻana kikoʻī.

    Kākau i kāu leka ma aneʻi a hoʻouna iā mākou