Pahu RT QuantScript

Hoʻohaʻahaʻa ʻia ʻo A-1 RNA

——E hoʻomaʻemaʻe i ka RNA kiʻekiʻe me ka hoʻohaumia ʻole. Pono e mālama i nā mea mai RNA i lawe ʻia e pale ai i ka hoʻohaʻahaʻa RNA. Nānā i ka pono RNA ma ka gel denatured ma mua o ka hopena RT. Ma hope o ka hemo ʻana o RNA, pono e mālama ʻia ma 100% formamide. Inā hoʻohana ʻia ka mea kāohi ʻo RNase, pono ka mahana hoʻomehana <45 ° C, a ʻo ka pH ma lalo o 8.0, i ʻole e hoʻokuʻu ka mea pāpā i nā RNase āpau i hoʻopaʻa ʻia. Eia kekahi, pono e hoʻohui i ka mea kāohi RNase i nā hopena i loaʻa ka 8 0.8 mM DTT.

Aia nā A-2 RNA i nā mea kūpale o nā huli hope transcription

——Ua hoʻopili nā mea hoʻohuli transcript me SDS, EDTA, glycerol, sodium pyrophosphate, spermidine, formamide, paʻakai guanidine, a pēlā aku. Hoʻohui i ka RNA kāohi me ka laʻana, a hoʻohālikelike i ka hua me ka hopena RNA kaohi e nānā inā aia he mea kāohi. E holoi i ka ua RNA me 70% (v / v) ethanol e hemo i nā mea kūpale.

A-3 lawa ʻole ka hoʻohui ʻāina o nā primers i hoʻohana ʻia no ka synthesizing ʻana i ka pae mua o cDNA

—— E hoʻoholo e kūpono ka mahana annealing no nā primers i hoʻohana ʻia i ka hoʻokolohua. No nā hexamers manuahi, koi ʻia e mālama i ka mahana ma 25 ° C no 10 min ma mua o ka hōʻea ʻana i ka mahana hana. No nā primers kikoʻī (GSP), e hoʻāʻo i kahi GSP ʻē aʻe, a i ʻole hoʻololi i ka oligo (dT) a i ʻole hexamer random.

A-4 Liʻiliʻi o ka hoʻomaka ʻana iā RNA

——E hoʻonui i ka nui o ka RNA. No nā laʻana RNA ma lalo o 50 ng, 0.1 μg a 0.5 μg acetyl BSA hiki ke hoʻohana ʻia i ka strand cDNA synthes mua.

A-5 ʻAʻole hōʻike ʻia ke ʻano pahuhopu i nā aʻa i nānā ʻia.

——E hoʻāʻo i nāʻiʻo.

Hoka A-6 PCR

——No RT-PCR ʻelua ʻanuʻu, ʻaʻole hiki ke anakuhi cDNA i ka ʻanuʻu PCR ma mua o 1/5 o ka nui o ka pane.

A-1 Hoʻohui kūlike ʻole o nā primers a me nā template

——ʻO ka 3'-end o nā primers ʻaʻole pono e loaʻa iā 2-3 dG a i ʻole dC. E hoʻohana i nā primers kikoʻī Gene i ka syntandy strand mua ma kahi o nā primer random a i ʻole oligo (dT). E hoʻohana i kahi mahana annealing kiʻekiʻe ma nā pōʻaiapuni mua, a laila ka mahana annealing haʻahaʻa. E hoʻohana i ka hoʻomaka-wela Taq DNA polymerase no PCR e hoʻomaikaʻi ai i ka kikoʻī o ka hopena.

A-2 Hoʻolālā maikaʻi ʻole o nā primers kikoʻī

——E hāhai i nā loina like no ka hoʻonui ʻana i ka hoʻolālā primer.

A-3 RNA i hoʻohaumia ʻia me ka genomic DNA

—— Hana iā RNA me PCR-grade DNase I. Hoʻonohonoho i kahi hopena kaohi me ka ʻole o ka transcription huli e ʻike ai i ka hoʻohaumia ʻana o DNA.

A-4 Hoʻokumu i ka dimer primer

—— Hoʻolālā i nā primers me ka ʻole o nā kaʻina kōkua ma ka hope 3 '.

A-5 kiʻekiʻe loa Mg²⁺ noʻonoʻo

——E hoʻopau iā Mg²⁺ ka noʻonoʻo no kēlā me kēia anakuhi a me ka hoʻohui primer

Hoʻopili ʻia ʻo A-6 me DNA haole

—— E hoʻohana i nā ʻōlelo aʻoaʻo kūpaʻa i nā aerosol a me nā enzyme UDG.

A-1 kiʻekiʻe loa ka ʻike o ka huahana strand mua

——E hoʻemi i ka nui o ka huahana strand mua i ka paepae hopena PCR maʻamau.

A-2 ʻOi aku ka nui o ka primer nui i ka hopena PCR

——E ho'ēmi i ka hoʻokomo o ka primer.

A-3 Nui loa nā pōʻaiapuni

——E hōʻoia i nā ʻano hopena PCR a hoʻemi i ka helu pōʻai o PCR.

A-4 Haʻahaʻa annealing wela wela

—E hoʻonui i ka mahana annealing e pale ai i ka hoʻomaka ʻole kikoʻī ʻana a me ka hoʻolōʻihi.

A-5 Hoʻonui i ka kikoʻī o nā ʻāpana oligonucleotide i hoʻokumu ʻia e DNase degradation o DNA -

RT-PCR e hoʻohuli i ka unuhi hou ʻana iā RNA i cDNA, a laila e hoʻohana i ka cDNA i unuhi hou ʻia ma ke ʻano he anakuhi no ka hopena PCR e hoʻonui ai i ka ʻāpana pahuhopu. Koho i nā primers kaulele, Oligo dT a me nā geners kikoʻī kikoʻī e like me nā kūlana kikoʻī o ka hoʻokolohua. Hiki ke hoʻohana ʻia nā primer a pau i luna no ka mRNA cell eukaryotic pokole me ka ʻole o ka hanana hairpin.

Random primer: Kūpono no ka RNA lōʻihi me ke ʻano hairpin, a me nā ʻano RNA āpau e like me rRNA, mRNA, tRNA, a pēlā aku. Hoʻohana nui ʻia lākou no ka hopena RT-PCR o hoʻokahi anakuhi.

Oligo dT: Kūpono no RNA me ka huelo PolyA (prokaryotic RNA, ʻaukaryotic Oligo dT rRNA a me tRNA ʻaʻohe huelo PolyA). Ma muli o ka paʻa ʻana o Oligo dT i ka huelo PolyA, koi ʻia ke kiʻekiʻe o nā laʻana RNA e kiʻekiʻe, a ʻo kahi liʻiliʻi o ka hoʻohaʻahaʻa e hoʻoliʻiliʻi nui ia i ka nui o ka synthes cDNA piha.

ʻO ka primer kikoʻī Gene: Hoʻohui i ke kaʻina anakuhi, kūpono i nā kūlana kahi i ʻike ʻia ai ke kaʻina target.

ʻElua ala:

1. Ke ʻano kuhikuhi kūloko: I ke kumumanaʻo, cDNA nā ʻāpana DNA o nā lōʻihi like ʻole, no laila ka smear ka hopena o electrophoresis. Inā haʻahaʻa ka nui o RNA, ʻaʻohe huahana e hōʻike i electrophoresis, akā ʻaʻole ia he manaʻo ʻaʻole e hoʻonui ʻia kahi huahana e PCR. Ma ke ʻano laulā, hiki ke hoʻohana i ka kūmole kūloko e ʻike ai iā cDNA. Inā loaʻa nā hualoaʻa o ka kūloko, hiki ke hōʻoiaʻiʻo ʻia ka maikaʻi o cDNA (i kekahi mau hihia, inā lōʻihi ke ʻāpana o ka ʻāpana target, aia paha he mau ʻokoʻa).

2. Inā aia kekahi ʻiʻo i ʻike ʻia e hoʻonui ʻia e kēia anakuhi, hiki ke hōʻoia ʻia e nā primers o kēia gen. ʻAʻole ka manaʻo o ka hoʻonui ʻana i kahi kūloko i ka manaʻo ʻaʻohe pilikia me cDNA. Ma muli o ka nui o ka ʻike kūloko i ka cDNA, maʻalahi ka hoʻonui ʻana. Inā hoʻohaʻahaʻa hapa ʻia ʻo cDNA no nā kumu like ʻole, mai ke kuanaʻike o ka likelika, e hoʻopili nui ʻia nā hopena PCR o nā genes target low haʻahaʻa. ʻOiai kiʻekiʻe o ka nui o ka kūloko, ʻaʻole paha e hoʻopili ʻia ka hoʻonui ʻana.

Hoʻohaʻahaʻa hapa o RNA. Kuhi i ka pono a hoʻomaʻemaʻe o RNA

ʻOkoʻa ka ʻike o ka RNA o nā ʻano like ʻole, akā i ka laulā, pono i ka RNA i unuhi ʻia i ʻelua mau pūʻulu 28S a me 18S i hoʻoili ʻia i nā gel electrophoresis, a ʻo ka ʻōlinolino o ka pā mua e ʻoi aku ka kiʻekiʻe ma mua o ka hope. Hōʻike ka pae 5S i ka hoʻohaʻahaʻa ʻia o RNA, a kūlike ka ʻōlinolino i ka pae o ka hoʻohaʻahaʻa. ʻO ka hoʻonui ʻana i ke kūmole kūloko ʻaʻole ia he kumu no ka pilikia ʻole o ka RNA, no ka mea, ʻo ka nui o ka kūloko kūloko, hiki ke hoʻonui ʻia ʻo RNA inā ʻaʻole koʻikoʻi ka hoʻohaʻahaʻa. ʻO ka OD₂₆₀/ OD₂₈₀ka lakio o ka RNA maʻemaʻe i ana ʻia e ka spectrophotometer ma waena o 1.9 a me 2.1. ʻO kahi liʻiliʻi o ka haumia protein i RNA e hōʻemi i ka lakio. ʻOiai ʻaʻole haʻahaʻa ka waiwai, ʻaʻole e hoʻopili ʻia ka RT. ʻO ka mea nui no RT ka pono RNA.

ʻO ka hoʻolōʻihi ʻia o ka ʻāpana kūmole kūloko hiki ke hōʻike wale ua kūleʻa ʻo RT, akā ʻaʻole ia e pili pono i ka maikaʻi o ka strand cDNA. Ma muli o ka liʻiliʻi o ka nui o nā ʻāpana kūmole i ka nui a kiʻekiʻe ke ʻano o ka ʻōlelo, ʻoi aku ka maʻalahi o ka kūleʻa ʻana i ka unuhi hou. Eia nō naʻe, ʻokoʻa ka nui a me ka haʻi ʻana o ka ʻāpana target i kēlā me kēia ʻāpana. ʻAʻole hiki ke hoʻokolokolo ʻia ka maikaʻi cDNA e ka kūmole kūloko ʻoiai no nā ʻāpana pahuhopu i ʻoi aku ma mua o 2 kb.

Loaʻa i kekahi mau laʻana nā hale kekona paʻakikī, a i ʻole ka waiwai GC momona, a i ʻole mea makamae me ka haʻahaʻa haʻahaʻa. I kēia mau hihia, pono e koho ʻia i transcriptase huli kūpono e like me ka nui o ka ʻāpana target a me ka laʻana. No nā anakuhi RNA me ka ʻike GC kiʻekiʻe a me ka hale lua paʻakikī, paʻakikī e wehe i ka hale lua i ka mahana haʻahaʻa, a i ʻole transcriptase hoʻi maʻamau. No kēia mau anakuhi, hiki ke koho ʻia ʻo Quant Reverse Transcriptase, no ka mea, ʻoi aku ka maikaʻi o kāna hana transcription ma mua o ka M-MLV series reverse transcriptase, i hiki ke hoʻohuli i ka transcript i nā template RNA me ka maikaʻi a unuhi i ka RNA i loko o ka cDNA pae mua i ka palena nui. Ke hoʻohana nei i ka kit transcriptase huli maʻamau, hiki i ka ʻōnaehana 20 μl ke hoʻohuli pono i ka transcript 1 μg o ka huina RNA. E ʻoluʻolu e hoʻolohe i ka nui o ka mana RT o ka kit. Inā hoʻohui ʻia ke anakuhi i ka nui aʻe, e aloha ka transcription huli i ka RNA me ka nui nui. No laila, ʻoi aku ka maikaʻi ʻaʻole e ʻoi aku i ka palena nui o ka ʻōnaehana.

A-1 Hoʻoholo inā hoʻohaʻahaʻa loa ʻia RNA a inā kūleʻa ʻo RT

Ma ke ʻano laulā, ʻo ke kumu o ka holo pono ʻole o ka hoʻonui i ka hoʻonui i ka hoʻonui pinepine ʻia ʻana e ka degradation RNA koʻikoʻi. ʻO kekahi kumu kūpono ke hoʻohuli hoʻohuli hoʻohoka ʻole. ʻAʻole hiki ke hoʻohana ʻia kahi kūmole kūloko i mea maʻamau e hoʻokolokolo ai i ka maikaʻi o cDNA strand hoʻokahi, akā hiki ke hoʻohana ʻia ma ke ʻano he hoʻokolokolo no ka kūleʻa ʻana o ka transcription hoʻohuli inā ʻaʻohe pilikia o ka maikaʻi RNA. ʻO ka mea nui i ke kaʻina transcription huli e mālama i ka mahana mau a me ka ʻōnaehana hopena mau i mea e hoʻomaikaʻi ai i ka hopena o ka hopena.

A-2 E hoʻoholo inā he hilinaʻi nā primers no ka hoʻonui ʻana i nā genes kūloko a inā he pilikia me nā reagents i hoʻohana ʻia ma PCR.

No ka helu kikoʻī ʻana, pono e helu ʻia ka RNA ma mua o ka huli hou ʻana, a koi ʻia hoʻi i nā kime unuhi hope he nui, no ka laʻana, e helu i ka hoʻokomo RNA me 1 μg. ʻOiai ʻo ka cDNA huli i huli ʻia he hopena kāwili ʻia, e laʻa me RNA, oligo dT, enzyme, dNTP, a ʻo kahi koena hoʻi o DNA, e hoʻoili ʻia ka hoʻololi, no laila ʻaʻole hiki ke helu pono i ka cDNA. No laila, pono ka helu RNA. Ke noʻonoʻo nei i ka pono o ka transcription hope he mea like ia i waena o nā laʻana like ʻole, ʻo ka nui o cDNA i loaʻa e like ia, a hiki i ka hōʻuluʻulu helu ke hōʻike i ka hoʻohālikelike o nā pae hōʻike o nā genes ʻokoʻa i ka nui like o ka nui RNA. Ke hana nei i ka PCR helu nui fluorescence, ʻaʻole pono e koi ʻia ka cDNA nui ma hope o ka hoʻohuli hou ʻana no ka mea hiki ke hana ʻia ka ʻāpana kūloko i kūmole.

Pili nui ia i nā ʻiʻo, a ʻaʻole hiki ke huli i ka palapala i nā ʻāpana lōʻihi no ka hapa nui o nā ʻiʻo. ʻO ka mea mua, ʻoi aku ka haʻahaʻa o ka pono o ka huli hope ʻana ma mua o ka PCR. ʻO ka lua, ʻo ka ʻāpana waiwai GC a me ke ʻano ʻelua o nā ʻāpana he nui e pāpā ana i ka transcription hope a me ka PCR. ʻO ka mea hope loa, paʻakikī ka hōʻoiaʻiʻo a me ka hoʻonui amplification o PCR i ka manawa like. I ke kaʻina o ka huli hou ʻana, ʻaʻole hiki i kekahi ke hōʻoia i ka loaʻa ʻana o kahi ʻāpana lōʻihi no nā genes kope haʻahaʻa, keu hoʻi me ka hoʻohana ʻana i ka oligo dT. No 5 'UTR me nā GC hou aku, ʻoi aku ka paʻakikī. No laila, he ʻano kūpono nō ia e hoʻohuli i ka transcript me nā primer random, e ʻike i nā kahua cleavage kūlohelohe i ka ʻāpana pahuhopu, hoʻonui ʻia e nā ʻāpana, a laila hana i ka palena o ka digestion a me ka ligation. Ma ka laulā, paʻakikī e hoʻonui pololei i nā ʻāpana i ʻoi aku ma mua o 2 kb, akā ʻaʻole hiki ʻole ke kiʻi ʻia i nā manawa āpau: 2.M-MLV RT-PCR kit hiki ke hoʻohana pono ʻia. E hoʻolōʻihi i ka manawa hoʻohui ʻāina a hoʻonui i ka helu pōʻaiapuni i ke kaʻina hoʻonui. ʻOkoʻa, hiki ke hoʻopili ʻia PCR i hoʻopaʻa ʻia, a i ʻole lawe i hoʻokahi a i ʻole ʻelua mau hopena me ka denaturation hoʻolōʻihi ʻia a me ka manawa hoʻonui ma mua o ka hoʻonui ʻana o PCR maʻamau, i hiki ke kōkua i ka hoʻolōʻihi ʻana i nā ʻāpana. E hoʻolohe i ka kūpaʻa o ka polymerase. 3.Long Taq hiki ke hoʻohana i PCR e loaʻa ai nā hopena maikaʻi. 4.No ka noi expression protein, pono e hoʻopili i ka polymerase pono kiʻekiʻe.

ʻElua ʻano o hope transcriptase i hāʻawi ʻia e TIANGEN: Quant / King RTase a me TIANScript M-MLV. ʻO ka ʻokoʻa nui ma waena o lākou ka nui o nā template. ʻO Quant kahi transcriptase huli kū hoʻokahi, ʻokoʻa ia mai ka M-MLV i hoʻohana mau ʻia i loaʻa mai iā Moloney murine leukemia virus. ʻO Quant kahi transcriptase huli hou kū pono kiʻekiʻe i hōʻike hou ʻia e ka ʻenehana ʻo Escherichia coli. Kūpono ʻo Quant no ka hoʻonui ʻana i 50 ng-2 μg o RNA me ka hana transcriptional kiʻekiʻe a me nā hua kiʻekiʻe. Hoʻohālikelike ʻia me MMLV maʻamau a i ʻole AMV, ʻo ko Quant ʻano nui loa ʻo ia ka ikaika loa o ka pilina me nā template RNA a hiki ke hoʻohuli i nā template transcript me ka ʻole o ka mahana kiʻekiʻe. No nā anakuhi me ka ʻike GC kiʻekiʻe aʻe, ʻoi aku ka kiʻekiʻe o ka huli i hope. Eia nō naʻe, he hana RNase H kēia transcript hope, i hiki ke hoʻopili i ka lōʻihi o ka huahana cDNA (kūpono no nā template <4.5 kb). No ka transcript huli maʻamau, paipai ʻia ʻo TIANScript MMLV huli transcriptase. ʻO kēia RTase kahi enzyme i hoʻololi ʻia me ka hana RNase H nāwaliwali loa, kahi kūpono no ka synthes cDNA lōʻihi (> 5 kb).

Hoʻopau hoʻokahi transcript huli a me ka hoʻonui PCR i ka paipu like me ka wehe ʻole o ka uhi o ka pahu ma waena o ka synthes cDNA a me ka hoʻonui ʻana, he mea kōkua ia e hōʻemi i ka haumia. Ma muli o ka hoʻohana ʻia ʻana o nā laʻana cDNA āpau no ka hoʻonui ʻana, ʻoi aku ka kiʻekiʻe o ka ʻike, me ka liʻiliʻi o 0,01 pg o ka huina RNA. No ka holomua RTPCR o hoʻokahi anuu, hoʻohana pinepine ʻia nā primers kikoʻī e hoʻomaka i ka synthes cDNA. ʻO ke ala ʻelua ʻanuʻu, ʻo ia hoʻi ka transcription hope a me ka hoʻonui ʻana o PCR i nā ʻanuʻu ʻelua. Lawe mua ʻia ka transcription hoʻohuli ʻia mai kahi anakuhi RNA e kiʻi iā cDNA, a hāʻawi ʻia ka cDNA i loaʻa i hoʻokahi a i ʻole nā ​​ʻano ʻē aʻe PCR. Hiki i ke kiʻina ʻanuʻu ʻelua ke hoʻohana i ka oligo (dT) a i ʻole nā ​​primers kaulele e alakaʻi i ka synthesis o ka strand mua o cDNA, a hiki ke hoʻohuli i ka lawe ʻana i ka ʻike mRNA āpau mai kahi laʻana kikoʻī.