TIANSeq mRNA Pahu Hopu

I kēia manawa, hoʻokumu ʻia ka ʻenehana hoʻonohonoho kiʻekiʻe-kiʻekiʻe ma luna o ka ʻenehana hōʻuluʻulu hanauna hou. Ma muli o ka palena o ka lōʻihi o ka heluhelu ʻana o ka ʻenehana hōʻuluʻulu hanauna, pono mākou e uhaʻi i ke kaʻina lōʻihi piha i nā waihona puke liʻiliʻi i ke kaʻina. Wahi a nā pono o nā hoʻokolohua hoʻonoho ʻokoʻa, koho mau mākou i ka hoʻokaʻina hopena hoʻokahi a i ʻole ke kaʻina ʻālua. I kēia manawa ua hāʻawi ʻia nā ʻāpana DNA o ka waihona puke moʻokūʻauhau aʻe i ka laulā o 200-800 bp.

a) maikaʻi ʻole ʻo DNA i ka maikaʻi a loaʻa nā mea kūpale. E hoʻohana i nā laʻana DNA kiʻekiʻe loa e pale i ka pāpā ʻana i ka hana enzyme.

b) ʻAʻole lawa ka nui o nā hāpana DNA i ka hoʻohana ʻana i ka hana manuahi PCR e kūkulu i ka waihona DNA. Ke piʻi ka input o ka fragmented DNA ma mua o 50 ng, hiki i ke kaʻina hana PCR ʻole ke hoʻokō ʻia i ka wā o ka hana hale waihona. Inā haʻahaʻa loa ka helu kope o ka waihona e hoʻopili pololei ʻia, hiki ke hoʻonui ʻia ka waihona DNA e PCR ma hope o ka ligation adapter.

c) Hiki i ka hoʻohaumia RNA ke kuhi hewa ʻole i ka helu DNA mua i loaʻa i ka hoʻomaʻemaʻe DNA i ka hana hoʻomaʻemaʻe o DNA genomic, i hiki ai ke alakaʻi i ka helu DNA kūpono ʻole a me ka lawa ʻole o ka hoʻouka ʻana o DNA i ka wā o ke kūkulu hale waihona. Hiki iā RNA ke hemo e ka mālama ʻana me RNase.

A-1

a) ʻIke ʻia nā ʻāpana liʻiliʻi (60 bp-120 bp) Hiki i ka hoʻomaʻemaʻe me nā lei manoa Agencourt AMPure XP ke lawe pono i kēia mau ʻāpana adapter a hōʻoia i ke ʻano o ke kaʻina.

b) Hōʻike nā ʻāpana nui i ka waihona ma hope o ka hoʻonui ʻana o PCR E hoʻonui ka nui o ka waihona DNA waihona i 120 bp ma hope o ka hoʻopili ʻia ʻana o ka adapter. Inā hoʻonui ka ʻāpana DNA ma mua o 120 bp ma hope o ka ligation adapter, kumu ʻia ia e ka ʻāpana fragment abnormal o ka hoʻonui PCR nui. Hiki ke hōʻemi i ka helu o nā pōʻai PCR i ke kūlana.

c) Ka nui kūpono ʻole o nā ʻāpana DNA waihona ma hope o ka hoʻopili ʻana o ka adapter ʻO ka lōʻihi o ka mea hoʻopili i kēia pahu he 60 bp. Ke hoʻopili ʻia nā wēlau ʻelua o ka ʻāpana i nā mea hoʻopili, e hoʻonui wale ka lōʻihi ma o 120 bp. Ke hoʻohana nei i kahi adapter ma waho o ka mea i hāʻawi ʻia e kēia kit, e ʻoluʻolu e hoʻokaʻaʻike i ka mea hoʻolako e hāʻawi i ka ʻike pili e like me ka lōʻihi o ka adapter. E ʻoluʻolu e hōʻoia i ka holo ʻana o ka hoʻokolohua a me ka hana i nā ʻanuʻu i wehewehe ʻia i loko o ka puke.

d) Ka nui o ka ʻāpana DNA ma mua o ka ligation adapter ʻO ke kumu o kēia pilikia e kumu ʻia e nā ʻano hopena hewa i ka wā o ka fragmentation DNA. Pono e hoʻohana i nā manawa ʻano ʻokoʻa no ka hoʻokomo DNA like ʻole. Inā ʻoi aku ka nui o ke komo ʻana o ka DNA ma mua o 10 ng, paipai mākou e koho i ka manawa hopena o 12 min e like me ka manawa hoʻomaka no ka optimization, a ʻo ka nui o ka ʻāpana i hana ʻia i kēia manawa ma ka pae o 300-500 bp. Hiki i nā mea hoʻohana ke hoʻonui a hōʻemi paha i ka lōʻihi o nā ʻāpana DNA no 2-4 min e like me kā lākou mau koi ponoʻī e hoʻonui ai i nā ʻāpana DNA me ka nui i koi ʻia.

A-2

a) ʻAʻole i hoʻomākaukau ʻia ka manawa haʻihaʻi Inā liʻiliʻi a nui paha ka DNA i hoʻokaʻawale ʻia, e ʻoluʻolu e nānā i nā kuhikuhi no ke koho ʻana i ka manawa wīwī i hāʻawi ʻia i ke kuhikuhi e hoʻoholo ai i ka manawa o ka hopena, a hoʻohana i kēia kiko manawa ma ke ʻano he kaohi, a hoʻonohonoho pū kekahi i ʻōnaehana hopena e hoʻolōʻihi a hoʻopōkole paha i 3 min e hana i ka hoʻoponopono pololei ʻana i ka manawa fragmentation.

A-3

Hoʻolaha ka nui maʻamau o DNA ma hope o ka mālama ʻana i ka ʻāpana

a) pololei ʻole ka hana hoʻoheheʻe o ka fragmentation reagent, a i ʻole ʻaʻole huikau piha ka reagent ma hope o ka hoʻoheheʻe ʻana. Hoʻohilahi i ka 5 × Fragmentation Enzyme Hoʻohui i ka mea huli i ka hau. I ka wā e hoʻoheheʻe ʻia, e kāwili like i ka mea reagent ma ke kahena ʻana i ka lalo o ka pahu. Mai vortex i ka mea kuhi kolohe!

b) Aia ka laʻana hoʻokomo DNA i loko o ka EDTA a i ʻole nā ​​mea hoʻohaʻahaʻa Depletion o nā iona paʻakai a me nā ʻoki chelating i ka hoʻomaʻemaʻe DNA kahi mea nui no ka kūleʻa o ka hoʻokolohua. Inā hoʻoheheʻe ʻia ʻo DNA i 1 × TE, e hoʻohana i ke ʻano i hāʻawi ʻia i ke kuhikuhi e hana ai i ka fragmentation. Inā maopopo ʻole ka manaʻo EDTA i ka hopena, koi ʻia e hoʻomaʻemaʻe i ka DNA a hoʻoheheʻe iā ia i ka wai deionized no ka hopena hou.

c) Kuhi pololei ʻana i ka helu DNA mua ʻAʻole pili ka nui o ka DNA ʻāpana i ka nui o ka hoʻokomo ʻana o DNA. Ma mua o ka mālama ʻana i ka fragmentation, ka nui o ka helu ʻana o DNA e hoʻohana nei iā Qubit, Picogreen a me nā ʻano hana ʻē aʻe e pono ai e hoʻoholo i ka nui kikoʻī o ka DNA i loko o ka ʻōnaehana hopena.

 d) ʻAʻole pili ka hoʻomākaukau o ka ʻōnaehana i ka ʻōlelo aʻo. I mea e hōʻoia ai i ka hopena maikaʻi, e kau ʻia nā ʻāpana hopena āpau ma ka hau a pono e hoʻokō ʻia ka hoʻomākaukau ʻana o ka ʻōnaehana hopena ma hope o ke anuanu piha. Ma hope o ka pau ʻana o ka hoʻomākaukau, e ʻoluʻolu lele a pipet paha e kāwili pono. Mai vortex!

1. ʻO ka hana hoʻohuihui kūpono ʻole (vortex, oscillation kolohe, a me nā mea ʻē aʻe) e hoʻohele pono ʻole i nā ʻāpana waihona (e like me ka mea i hōʻike ʻia ma ke kiʻi aʻe), a pēlā e hoʻopili ai i ka maikaʻi o ka waihona. No laila, i ka hoʻomākaukau ʻana i ka hopena hopena Fragmentation Mix, e ʻoluʻolu e pipette i luna a i lalo e hui, a i ʻole hoʻohana i ka manamana lima e lele a hui pono. E makaʻala i ka hui ʻole ʻana me ka vortex.

2. Pono e hoʻohana i ka DNA maʻemaʻe kiʻekiʻe no ka hana hale waihona

■ Pono pono DNA: ʻOi aku ka lōʻihi o ka electrophoresis ma mua o 30 kb, me ka ʻole o ka huelo

■ OD260 / 230:> 1.5

■ OD260 / 280: 1.7-1.9

3. Pono pono ka nui o ka hoʻokomo ʻana o DNA Kuhi ʻia e hoʻohana i nā hana Qubit a me PicoGreen e helu ai i ka DNA, ma mua o Nanodrop.

4. Pono e ʻike ʻia ka ʻike o EDTA i ka hopena DNA e pili ana ka mana o ka EDTA i ka hopena fragmentation. Inā kiʻekiʻe ka ʻike o EDTA, pono e hoʻomaʻemaʻe DNA ma mua o ka hōʻike hope.

5. Pono e hoʻomākaukau ka hopena hopena ma ka hau. Hoʻomaʻamaʻa ka hana fragmentation i ka mahana a me ka manawa o ka hopena (keu hoʻi ma hope o ka hoʻohui ʻana i ka enhancer). I mea e hōʻoia ai i ka pololei o ka manawa hopena, e ʻoluʻolu e hoʻomākaukau i ka ʻōnaehana hopena ma ka hau.

6. Pono e pololei ka manawa hopena fragmentation ʻO ka manawa hopena o ka ʻāpana fragmentation e hoʻopili pololei i ka nui o nā huahana fragment, no laila e hoʻopili ana i ka nui o ka hāʻawi ʻana o nā ʻāpana DNA i ka waihona.

1. He aha ke ʻano o ka laʻana e pili ana i kēia kini?

Hiki i ka laʻana kūpono kūpono o kēia kini RNA ke huina a i ʻole ka mRNA hoʻomaʻemaʻe me ka maikaʻi RNA maikaʻi. Inā hoʻohana ʻia ka RNA holoʻokoʻa e kūkulu i ka waihona, koi ʻia e hoʻohana i ka kit depletion rRNA (Cat # 4992363/4992364/4992391) e hemo mua i ka rRNA.

2. Hiki i nā laʻana FFPE ke hoʻohana i nā waihona me kēia kini?

E hoʻohaʻahaʻa ʻia ka mRNA i nā laʻana FFPE i kekahi nui, me ka pili pono ʻole o ka maikaʻi. Ke hoʻohana nei i kēia kini no ka hana hale waihona, koi ʻia e hoʻonui i ka manawa o ka fragmentation (hoʻopōkole i ka manawa o ka fragmentation a i ʻole hana i ka fragmentation).

3. Ke hoʻohana nei i ka ʻanuʻu koho nui i hāʻawi ʻia i loko o ka manual huahana, he aha ka mea e hōʻike ai i ka mahele i hoʻokomo ʻia e ʻike i ka hoʻololi iki?

E hoʻokō ʻia ka wae ʻana i ka nui e like me ka nui o ke koho ʻana i kēia kaʻina huahana. Inā loaʻa ke hoʻololi, ʻo ke kumu o ka kaulike ʻole o nā lei makika i ka mahana o ka lumi a ʻaʻole i huikau piha, ʻaʻole pololei ka pipette a koe paha ka wai i ka piko. Paipai ʻia e hoʻohana i nā ʻōlelo aʻoaʻo me ka adsorption haʻahaʻa no ka hoʻokolohua.

4. Koho o nā mea hoʻopili i ke kūkulu hale waihona

ʻAʻohe o ka pahu waihona kūkulu reagent, a paipai ʻia e hoʻohana i kēia kit me ka TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC o ka waihona

ʻImi i ka nui o ka waihona: Qubit a me qPCR e hoʻohana ʻia e hoʻoholo ai i ka lehulehu a me ka molar konsentration o ka waihona. Kūlike ka hana me ka manual huahana. ʻO ke ana o ka waihona e hoʻokō pono i nā koina o ke kuhi ʻana ʻo NGS. ʻIke i ka laulā waihona o ka waihona: e hoʻohana ana iā Agilent 2100 Bioanalyzer e ʻike ai i ka laulā waihona.

6. Koho o ka helu hoʻokahuli hoʻonui

Wahi a nā ʻōkuhi, ʻo ka helu o nā pōʻaiapuni PCR he 6-12, a ʻo ka helu o nā pōʻaiapuni PCR e pono ai e koho ʻia e like me ka hoʻokomo o ka hāpana. I nā hale waihona puke hua kiʻekiʻe, ʻoi aku ka hoʻonui ʻana o ka hoʻonui ʻana i nā kekelē like ʻole, i hōʻike ʻia e kahi piko liʻiliʻi ma hope o ka piko o ka pae pahuhopu i ka ʻike ʻana o Agilent 2100 Bioanalyzer, a i ʻole ka haʻahaʻa o Qubit i ʻike ʻia ma lalo o ka qPCR. ʻO ke akahai ma luna o ka amplification kahi hanana maʻamau, ʻaʻole ia e pili i ka hōʻiliʻili ʻana o ka waihona ma nā ʻikepili a me nā ʻikepili ma hope.

7. ʻIke ʻia nā mākia i ka ʻike ʻike o Agilent 2100 Bioanalyzer

ʻO ke ʻano o nā kui i Agilent 2100 ʻike ʻo Bioanalyzer ma muli o ka mahele ʻole o nā ʻāpana, kahi e nui ai nā ʻāpana i kekahi nui, a e ʻike maopopo ʻia kēia ma hope o ka hoʻonui ʻana o PCR. I kēia hihia, ua manaʻo ʻia ʻaʻole e hana i ka wae koho, ʻo ia ka hoʻonohonoho ʻana i ke ʻano o ka fragmentation i ka 94 ° C no 15 min i hoʻouluulu ʻia, kahi e liʻiliʻi ai ka mahele o ka ʻāpana, a hiki ke hoʻomaikaʻi ʻia ka homogeneity.